PROCEDIMIENTO CORTE A MANO ALZADA

Fig 1. Tincion con Fast Green

Fig 2. Diferentes colorantes

Materiales:

- Muestra de la planta a trabajar que este fresca

- Cuchilla minora nueva para que el corte sea lo más impecable posible.

- Placas

- Cubreobjetos

- Colorantes Safranina, Fast-green,

- Glicerina

- Agua destilada

Metodos:

1. Se lava la parte de la planta a la cual se le vaya a realizar la coloración y la respectiva observación.

2. Realizar los cortes con la cuchilla nueva, bajo el estereoscopio para poderlos realizar con precision.

3. Tratar de mantener humeda la muestra con un poco de agua destilada mientras se realiza el corte ya que la luz del estereoscopio hace que la muestra se vaya deshidrtando y se queme.

4. una vez realizado el corte, proceder a tenir con Safranina o Fast-Green y dejar actuar el colorante durante 1 minuto.

5. Pasado el minuto de la coloración lavar cuidadosamente con agua destilada para quitar el exceso de colorante.

6. Una vez retirado el exceso de colorante y de haber secado con una toallita de papel el exceso de agua, añadir 1 gota de glicerina.

7. Cuando ya tenga glicerina la muestra, cubrir con cubreobjetos y observar al microscopio.

Nota: esta tecnica es muy eficiente para las diferentes practicas que se realizan semanalmente en los laboratorios, ya que es rápida y nos permite ver casi de forma inmediata lo que se esta viendo en la teoria. Para los cortes de plantas que realizamos en la materia de Histo-morfología vegetal, tuvimos que tener en cuenta que las plantas escojidas para el trabajo de todo el semestre no fueran leñosas ya que esto dificultaria mucho los cortes con la cuchilla.

TECNICAS HISTOLOGICAS EN VEGETALES

Fig. 1 Diferentes recipientes que contenian alcoholes para la deshidatacion



Fig. 2. Horno donde se calientan las muestras para la incubacion



Fig. 3. Corte al microtomo

Fijación en: Solución en AFA

- 85 c.c de alcohol al 80%
- 10 c.c de formol al 37-40%
- 5 c.c de ácido ácetico glacial
- Tiempo de fijación 24 horas como mínimo

Ventajas: Preserva la mayoría de las estructuras celulares en casi todas las plantas jóvenes, compatible con la mayoría de los colorantes y se puede pasar del fijador al primer alcohol.

Desventajas: No se puede guardar permanentemente en el fijador AFA, lo mejor es guardarlo en alcohol etílico al 70% no es recomendado para tejidos meristemáticos y tejidos donde queramos ver mitosis y cromosomas.

Deshidratación: Deshidratación con alcoholes ascendentes: Alcohol 70º-80º-90º 100% I, 100%II, 100%III. Si el `proceso es manual dejar el tejido 24 horas en cada alcohol y como mínimo 12 horas.

Aclaramiento: Xilol I y Xilol II, 6 horas en cada uno (el xilol endurece los tejidos vegetales en especial el tejido leñoso). En remplazo del xilol utilizamos alcohol butílico terciario o terbutanol que se calienta al baño de maria para diluirlo.

1. Terbutanol 1 parte por 3 de alcohol etílico al 100%

2. Terbutanol 2 partes con 2 de alcohol etílici al 100%

3. Terbutanol 3 partes con 3 de alcohol étílico al 100%

4. Terbutanol puro.

Seis horas en cada uno de los cuatro pasos a una temperatura de 37ºc

Inhibición: De xilol a pararafina I, parafina II, 12 horas en cada una. (temperatura 53º, 56) si es con terbutanol una parte de terbutanol y una parte de parafina a una temperatura de 30º a 40º; temperatura de la parafina (53º 56º) hasta que el terbutanol se evapore, y colocamos el tejido vegetal en parafina pura hasta por 72 horas, hasta que no huela más a terbutanol.

Inclusión: En parafina donde se coloca el tejido vegetal según la orientación del corte en moldes plásticos.

Corte al micrótomo: El corte al microtomo se realizo de 15 micras, que se toman en el portaobjetos en el flotador de tejidos y se llevan a un horno incubadora a una temperatura de 37º a 40º por 12 horas.

Coloración: Safranina 4 gr, Methyl celloselve, Ethanol 50% 200 c.c, acetato de sodio 4 gr, Formol puro 8 c.c.

Disolver la safranina en el metíl celloselve en un agitador magnético y agregamos los otros componentes en el mismo orden. Tiempo de tinción en la safranina o por 12 horas, las hojas mayor tiempo. Lavar con agua corriente muy suave.

Alcohol ácido pícrico solución saturada

Alcohol I de 70º, 80º, y 90º.

Fast green FCTCI42053

Solución madre de Fast- Green: Fast-green FCT 3 gr, etanol absoluto 50 c.c y metil celloselve 50 c.c y los 3 gr de Fast-green FCT.

Solución de trabajo: Fast-green FCT 1 parte y 3 partes de esencia de clavos; agregar safranina al gusto por un minuto. Deshidrataciones con alcoholes ascendentes aclarar en xilol y montar con resina.